王詩嘉，和月強(qiáng)，葉珊，常青，李韌，丁書茂
華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430079
摘要：為了初步研究鄰苯二甲酸二乙基己酯（Di（-2-ethylhexy）phthalate,DEHP）對植物幼苗的氧化損傷作用，采用不同濃度（0.2、2、20、200mg·kg-1（細(xì)沙））DEHP對蠶豆的根部染毒，分析了DEHP對蠶豆幼苗莖、葉中的過氧化物酶（POD）及丙二醛（MDA）含量的影響.結(jié)果表明，處理7d后，隨DEHP濃度的升高，蠶豆幼苗莖、葉POD活性均呈先升高后降低趨勢，較高濃度組（莖：≥2mg·kg-1；葉：≥20mg·kg-1）與對照組差異顯著（p<0.05）；MDA含量均呈逐漸升高趨勢，較高濃度組（≥2mg·kg-1）與對照組差異顯著（p<0.05或p<0.01）.以上結(jié)果表明，DEHP可造成蠶豆幼苗氧化損傷.
關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二乙基己酯；蠶豆；抗氧化酶；丙二醛；過氧化物酶
文章編號：1673-5897（2010）4-587-05中圖分類號：X171.5，X592文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
1·引言（Introduction）
酞酸酯類化合物（Phthalatic-acid esters,PAEs）是一類人工合成的有機(jī)化合物，由于其優(yōu)良的化學(xué)性質(zhì)而被廣泛用于塑料增塑劑、食品包裝材料、頭發(fā)定型劑、容器、潤滑劑、醫(yī)療用品及人造革等方面.在各種酞酸酯類化合物中，鄰苯二甲酸二乙基己酯（di（-2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）的應(yīng)用最為廣泛.據(jù)統(tǒng)計，目前DEHP的全球年產(chǎn)量已升至每年約350×104（tBornehag et al.,2004）.研究表明，DEHP可對動物的生殖器官、血液、腎臟、肺臟、肝臟等多種器官造成損傷（陳莉等，2008;常青等，2008），尤其是孕婦和發(fā)育期兒童對DEHP的毒作用非常敏感（Helm,2007;陳志良等，2001）.
隨著塑料薄膜的廣泛應(yīng)用以及大量城鎮(zhèn)污水和垃圾被排放到農(nóng)田，越來越多的DEHP被釋放進(jìn)入農(nóng)田土壤，成為農(nóng)田土壤中最常被檢出的有機(jī)污染物，其含量有時甚至高達(dá)20mg·kg-（1干土），高出土壤本底值幾十倍（王愛國和羅廣華，1990）.因此，土壤中DEHP的殘留對植物體的影響目前受到普遍關(guān)注.研究表明，DEHP在植物的根、莖、葉均有不同程度的殘留（Rong and Yin,2004），植物莖、葉和根系對DEHP的吸收累積存在明顯差異（曾巧云等，2007）.目前關(guān)于DEHP對植物的影響研究主要集中在DEHP在植物中的殘留以及植物體中DEHP的檢測（叢惠芳等，2008;寇立娟等，2007），關(guān)于DEHP對植物體的氧化損傷報道尚不多見.前期研究結(jié)果顯示，DEHP對蠶豆種子具有遺傳毒性，且使蠶豆幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性發(fā)生顯著變化（常青等，2008），本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了DEHP對蠶豆幼苗莖葉中過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量的影響，以期初步闡明DEHP殘留對植物體的氧化損傷作用.
2·材料與方法（Materials and methods）
2.1材料、儀器與主要試劑
材料：松滋青皮豆（Vicia faba），由華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供.
儀器：HP300 GS-C型智能人工氣候箱（武漢瑞華儀器設(shè)備有限公司）；低溫冷凍離心機(jī)（Eppendorf5415-R）；U-1800紫外可見分光光度計（日本日立）.主要試劑：DEHP，純度98%，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl，純度99.6%，Amresco分裝；三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、愈創(chuàng)木酚等其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為去離子水.
2.2實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)分為5組，即1個對照組，4個DEHP處理組.DEHP用吐溫-80溶解，DEHP、吐溫-80和水的比例為1:1:8.各組DEHP濃度分別為0、0.01、0.1、1、10mg·mL-1.
精選蠶豆種子，經(jīng)消毒、浸泡、催芽后植于細(xì)沙中培養(yǎng)蠶豆幼苗（細(xì)沙預(yù)先反復(fù)沖洗并高壓滅菌），待長至兩葉一心時移栽至鋪有細(xì)沙的解剖盤中，并用1/2Hoagland培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)（保持細(xì)沙7成濕潤），5d后更換一次細(xì)沙.再培養(yǎng)5d后移入含有DEHP和1/2Hoagland培養(yǎng)液的500g細(xì)沙中.實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每盆6株.處理過程中向細(xì)沙中分別加入適量的0.01、0.1、1、10mg·mL-1 DEHP儲存液，混勻，使終濃度分別為0.2、2、20、200mg·kg-1（細(xì)沙），1/2Hoagland培養(yǎng)液維持蠶豆苗生長，處理7d后取樣.
2.3測定方法
POD活性和MDA含量分別采用張志良（2004）和趙世杰等（1994）的方法進(jìn)行測定.
2.4統(tǒng)計學(xué)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Origin 7.0統(tǒng)計分析軟件處理，并進(jìn)行t檢驗(yàn)和繪圖.
3·結(jié)果（Results）
3.1不同濃度DEHP對蠶豆莖、葉POD活性的影響 不同濃度DEHP對蠶豆莖、葉POD活性的影響如圖1所示.總體而言，隨著DEHP濃度的升高，蠶豆莖、葉POD活性均呈先升高后降低趨勢.DEHP濃度在0~2mg·kg-（1細(xì)沙）時，隨DEHP濃度的升高，蠶豆幼苗莖、葉POD活性呈逐漸升高趨勢，其中2mg·kg-（1細(xì)沙）組葉中POD活性顯著高于對照組（p<0.05）.當(dāng)DEHP濃度為2~200mg·kg-1（細(xì)沙）時，POD活性逐漸降低，20、200mg·kg-（1細(xì)沙）組莖、葉POD活性均顯著低于對照組（p<0.05）.
3.2不同濃度DEHP對蠶豆莖、葉MDA含量的影響
不同濃度DEHP對蠶豆莖、葉MDA含量的影響如圖2所示.總體而言，隨著DEHP濃度的升高，蠶豆莖、葉MDA含量均呈逐漸升高趨勢.0.2mg·kg-（1細(xì)沙）組蠶豆莖、葉MDA含量與對照組沒有顯著差異（p>0.05），而2、20、200mg·kg-1（細(xì)沙）組蠶豆莖、葉MDA含量與對照組均有顯著差異（p<0.05或p<0.01）.
4·討論（Discussion） 植物體內(nèi)的過氧化物酶（POD）是一類重要的抗氧化酶，在清除有毒害物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧自由基和過氧化物、抑制膜脂過氧化、保護(hù)細(xì)胞免遭傷害等方面起著重要作用.生物體的抗氧化酶對污染物脅迫相當(dāng)敏感，其活性變化可為污染物脅迫下的機(jī)體氧化應(yīng)激提供敏感信息（薛銀剛等，2009）.因此抗氧化酶可以作為檢測環(huán)境污染物脅迫的生物標(biāo)記物（張志良和瞿偉菁，2003）.本研究結(jié)果顯示，DEHP濃度在0~2mg·kg-1（細(xì)沙）時，隨DEHP濃度的升高，蠶豆幼苗莖、葉POD活性逐漸升高，這是植物體為了保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫的傷害而提高了體內(nèi)抗氧化酶的活性.當(dāng)DEHP濃度為2~200mg·kg-1（細(xì)沙）時，POD活性又顯著降低，這可能是高濃度的DEHP脅迫超過了植物體內(nèi)POD等保護(hù)酶的承受極限而破壞了它們的功能，從而導(dǎo)致POD活性降低（Converso et al.,2000）.
由此可以推斷，DEHP可造成蠶豆幼苗的氧化損傷.正常條件下，植物能有效地清除體內(nèi)的活性氧自由基，使細(xì)胞免受傷害.逆境條件下，植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生速度超過了植物清除活性氧的能力，便會引起氧化損傷（費(fèi)偉等，2005;張清智等，2008）.研究表明，DEHP是一種過氧化物酶體增值劑（胡存麗和仲來福，2007），DEHP脅迫打破了植物體包括以活性氧為主的各種自由基產(chǎn)生和消除的平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高.POD是一種超氧自由基清除劑，其活性的高低與植物抗逆性大小有一定的相關(guān)性，在適度的逆境環(huán)境誘導(dǎo)下，POD利用H2O2來催化這些對植物自身有毒害的過氧化物（POD底物）的氧化和分解，以維持自身的正常代謝，從而誘導(dǎo)了POD活性的增加，提高了植物的適應(yīng)能力.隨著DEHP含量升高至200mg·kg-（1細(xì)沙），POD活性下降，可能是高濃度的DEHP脅迫激發(fā)了更多的細(xì)胞活性氧自由基的產(chǎn)生，超過了機(jī)體清除的能力，對植物組織細(xì)胞中的多種功能膜及酶系造成了破壞，從而抑制了其活性的增加.
植物在逆境脅迫過程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞從而導(dǎo)致活性氧積累.活性氧積累的危害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用.丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，其含量的高低代表了膜脂質(zhì)過氧化作用的程度（Atienzar etal.,2000），MDA能使酶分子中的氨基酸發(fā)生交聯(lián)、肽鏈斷裂，形成新的聚合物，從而產(chǎn)生新的大分子，使酶活性更新、喪失或改變，破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，造成膜內(nèi)外離子交換紊亂，加速自由基的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步加劇細(xì)胞膜的損傷（費(fèi)偉等，2005;陳曉曉等，2010）.在植物逆境生理研究中，MDA含量是一個常用指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)中，各DEHP染毒組蠶豆幼苗莖、葉中的MDA含量較對照組均有所增加，且在DEHP濃度較高時，與對照組存在顯著差異.這是由于DEHP脅迫導(dǎo)致莖、葉細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生與清除間平衡被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致膜脂過氧化加劇，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能遭破壞，細(xì)胞傷害加重，最終使MDA含量升高（陳曉曉等，2010）.此結(jié)果進(jìn)一步表明，DEHP處理可造成對蠶豆幼苗的氧化損傷.
綜合以上分析表明，DEHP對植物幼苗可產(chǎn)生明顯的氧化損傷.
